锐赛生物

靶标发现与功能验证基因操作和基因组编辑药物靶标开发生化/细胞水平验证高通量高内涵分析GPCR/核受体检测激酶检测体外药理学体外安全性评价药代动力学毒理学评价药代动力学/毒理学抗肿瘤药理评价代谢类和心脑血管疾病药理评价中枢神经系统药理评价炎症/自身免疫疾病药理评价体内药理学立项成果展示肿瘤个性化治疗项目QPCRWB检测ELISA检测甲基化检测SNP检测高效液相色谱法(HPLC)蛋白质谱基因芯片核酸EBET易博真人|平台EBET易博真人|平台EBET易博真人|平台、蛋白分析服务目的基因的ORF克隆化学合成质粒载体构建siRNA的细胞转染及筛选技术服务shRNA载体构建及筛选技术服务RNAi病毒包装及筛选技术服务miRNA的表达载体构建及病毒包装载体构建及筛选服务chipchip-seqIPCO-IPRNA免疫共沉淀(RIP)RNA pull down免疫共沉淀实验服务慢病毒包装腺病毒包装细胞培养原代细胞分离干细胞诱导分化CCK-8检测流式周期检测流式凋亡检测流式分选细胞流式鉴定细胞表面抗体活性氧(ROS)检测线粒体膜电位检测transwell检测管腔形成实验细胞黏附实验细胞克隆形成实验细胞免疫荧光检测稳转株构建双荧光素酶检测细胞干性成球能力磁珠分选细胞MDA(丙二醛)检测酶活动力学检测HDA检测细胞实验服务常规化学染色免疫组化(IHC)免疫荧光(IF)原位杂交(ISH)荧光原位杂交(FISH)原位末端标记染色(TUNEL)组织样本处理拍照处理病理学检测服务裸鼠皮下成瘤(CDX模型)人源肿瘤移植模型(PDX模型)糖尿病/肥胖模型心血管类疾病模型肾脏疾病模型肝脏疾病模型炎症与自身免疫疾病模型呼吸系统疾病模型其他疾病模型动物实验服务2019精品SCI2018精品SCI2017精品SCI往期精品SCI漂亮SCI案例库科研转化成果u.cad癌症筛查检测全外显子组基因检测其他疾病基因检测生物信息数据分析服务肿瘤学领域研究平台病理学中心实验室心血管与代谢领域疾病研究平台炎症与自身免疫疾病领域研究平台特发肺纤维化疾病领域研究平台抗体药物一体化临床前研发平台药性评价平台公司新闻价值金字塔三元悖论为客户赢得荣誉业务招商诚觅英才内部推荐加入我们留言板联系我们推荐朋友SCI论文发表奖励制度科研资助POLOdeliverer3000CCK-8Annexin V-FITCAnnexin V-RFPECL 发光液细胞周期与凋亡检测自研试剂基因质粒病毒免费送细胞库动物饲料促销活动

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联系电话:

021-80158420

双荧光素酶检测

Luciferase assay



实验原理


miRNA通过碱基配对结合到靶mRNA的3’UTR区EBET易博真人|平台EBET易博真人|平台,抑制靶基因的翻译或对靶基因mRNA的降解达到调控基因表达的目的。将靶mRNA的3’UTR区构建至萤火虫荧光素酶报告基因的3’端EBET易博真人|平台,与miRNA表达载体及海肾荧光素酶报告基因载体共转染细胞EBET易博真人|平台EBET易博真人|平台,先后加入两种底物荧光素,通过对荧光素酶报告基因的表达检测确认miRNA对靶基因的调控效果。下图为双荧光素酶报告基因检测载体的示意图EBET易博真人|平台。


图6.5 双荧光素酶报告基因检测系统示意图


技术应用


通过miRNA靶标的鉴定从而进行miRNA功能的深入研究EBET易博真人|平台。


实验流程




实物

数据信息

实验周期

客户提供

miRNA序列信息及靶点信息

10周

我们提供

质粒EBET易博真人|平台、菌株

基本实验步骤EBET易博真人|平台EBET易博真人|平台、测序报告、EXCEL原始数据



实验结果展示


图 1 hsa-miR-9-1 的靶点筛选结果
1)四组质粒的 293 细胞共转染后的细胞照片EBET易博真人|平台;2)四组细胞的双荧光素酶报告基因检测柱形图。
注:WT为野生型3'UTR 区的萤火虫荧光素酶报告基因质粒,Mut为突变型3'UTR 区的萤火虫荧光素酶报
告基因质粒EBET易博真人|平台EBET易博真人|平台,结果表明待研究的 miRNA 对靶基因有较明显的调控作用EBET易博真人|平台。


TROUBLESHOOTING

实验问题

原因

推荐解决方法

发光检测值过低EBET易博真人|平台EBET易博真人|平台EBET易博真人|平台?

荧光素酶表达多低

注意调整细胞状态EBET易博真人|平台EBET易博真人|平台EBET易博真人|平台、转染条件、转染量EBET易博真人|平台EBET易博真人|平台EBET易博真人|平台,提高发光值EBET易博真人|平台EBET易博真人|平台。

检测试剂

避免反复冻融以及保存时间过长。

发光检测值过高?

荧光素酶表达过高

建议通过降低转染量或减少检测体积等降低发光。


常见问题FAQ


Q :有哪些数据库可对miRNA的靶基因进行预测分析EBET易博真人|平台EBET易博真人|平台EBET易博真人|平台EBET易博真人|平台?

A :根据miRNA 5‘ 端2-8个核苷酸可与靶mRNA 3‘ UTR区完全互补这一特点,结合miRNA与靶基因形成二聚体的热力学稳定性和二级结构进行分析,有如下数据库的预测分析结果可供参考:


miRNA靶基因预测方法

检测范围

算法特点

miRanda


人EBET易博真人|平台,果绳EBET易博真人|平台EBET易博真人|平台,斑马鱼


序列匹配EBET易博真人|平台EBET易博真人|平台,双链结合自由能EBET易博真人|平台,物种间保守性

TargetScan

/TargetScanS

人,小鼠,大鼠EBET易博真人|平台EBET易博真人|平台EBET易博真人|平台,狗EBET易博真人|平台,鸡EBET易博真人|平台,蛙,黑猩猩EBET易博真人|平台,恒河猴EBET易博真人|平台,牛EBET易博真人|平台,负鼠

提出“miRNA种子区”的概念

RNAhybrid

哺乳动物

快速准确计算miRNA-mRNA二聚体自由能

DIANA-microT

人EBET易博真人|平台EBET易博真人|平台,小鼠,大鼠EBET易博真人|平台,果绳

考虑miRNA调控单个靶位

点的情况

PicTar

脊椎动物

区分“完全匹配种子区”与“不完全匹配种子区”

RNA22

哺乳动物

不考虑保守性EBET易博真人|平台,由mRNA入手预测相miRNA



Q :荧光素酶报告基因有哪些特点EBET易博真人|平台?有哪些应用?

A :在荧光素酶的催化下EBET易博真人|平台EBET易博真人|平台,荧光素可被氧化并释放光子EBET易博真人|平台EBET易博真人|平台,可用荧光检测仪对荧光定量测定EBET易博真人|平台EBET易博真人|平台。荧光素酶检测系统具有非放射性EBET易博真人|平台EBET易博真人|平台,灵敏度高的特点EBET易博真人|平台。荧光素酶咋哺乳动物细胞中的半衰期为3小时EBET易博真人|平台,半衰期短不发生积累,故调控元件的改变会即时导致荧光素酶活性的改变EBET易博真人|平台EBET易博真人|平台,可进行快速方便的分析EBET易博真人|平台。我们把感兴趣的基因转录的调控元件克隆在荧光素酶报告基因的上游或下游,构建成报告基因质粒EBET易博真人|平台,即可进行启动子、增强子的活性研究EBET易博真人|平台EBET易博真人|平台EBET易博真人|平台,miRNA的靶点筛选工作EBET易博真人|平台。


Q :荧光素酶的发光波长是多少EBET易博真人|平台?

A :萤火虫荧光素酶催化luciferin发光的最强发光波长为560nmEBET易博真人|平台EBET易博真人|平台。海肾荧光素酶催化coelenterazine发光的最强发光波长为465nmEBET易博真人|平台EBET易博真人|平台。


Q :荧光素酶检测系统需要制备标准曲线吗?

A :一般不需作标准曲线EBET易博真人|平台。荧光素酶检测系统用于比较样品的相对活性EBET易博真人|平台。


Q:双荧光素酶报告基因系统有何优点?

A:在双荧光素酶报告基因测试中,将萤火虫荧光素酶作为实验报告基因,海肾荧光素酶作为对照报告基因EBET易博真人|平台。实验报告基因用于测试实验条件下基因的表达,而对照报告基因作为内对照,以使实验报告基因测试的结果归一化EBET易博真人|平台。作归一化可消除实验过程中减弱实验准确度的变化,如培养细胞的数量EBET易博真人|平台、细胞转染及裂解的效率等。


Q:荧光素酶报告基因与GFP的区别是什么EBET易博真人|平台?

名称

检测方法

应用

特点

GFP绿色荧光蛋白

显微镜下直接观察

转染效率的检测或融合目的蛋白EBET易博真人|平台,观察蛋白表达情况

方便直观

荧光素酶报告基因

细胞裂解后加入底物在荧光检测仪中进行测定

研究启动子的功能与调控


可准确定量




参考文献

1. Lee DY, Deng Z,Wang CH, et al.MicroRNA-378 promotes cell survival, tumor growth, and angiogenesis by targetingSuFu and Fus-1 expression.PNAS 2007,(104):20350-20355.

2. Dong F, Lou D. MicroR NA-34b/c suppresses uveal melanoma cell proliferation and migration through multipletargets.Molecular Vision 2012,(18):537-546.

 
 
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